TIANSeq Kit ea Tekanyetso ea DNA (Illumina)

Hajoale, theknoloji ea tatellano ea maemo a holimo e thehiloe haholo ho theknoloji ea tatellano ea moloko o tlang. Ha bolelele ba ho bala ba theknoloji e latellanang ea moloko o tlang bo lekanyelitsoe, re tlameha ho arola tatellano e felletseng ka har'a lilaeborari tse nyane tsa likaroloana. Ho latela litlhoko tsa liteko tse fapaneng tsa tatellano, hangata re khetha tatellano e le 'ngoe kapa tatellano e habeli. Hajoale likaroloana tsa DNA tsa laeborari e latelang ea moloko o latelang li ajoa ka bongata ba 200-800 bp.

a) DNA ha e boleng bo botle ebile e na le lithibela-mafu. Sebelisa mehlala ea boleng bo holimo ea DNA ho qoba tšitiso ea tšebetso ea enzyme.

b) Palo ea sampole ea DNA ha ea lekana ha ho sebelisoa mokhoa o se nang PCR ho aha laeborari ea DNA. Ha ho kenyelletsoa ha DNA e arohaneng ho feta 50 ng, phallo ea mosebetsi e se nang PCR e ka etsoa ka mokhoa o khethiloeng nakong ea ts'ebetso ea kaho ea laeborari. Haeba nomoro ea kopi ea laeborari e le tlase haholo hore e ka latellana ka kotloloho, laeborari ea DNA e ka holisoa ke PCR kamora adapter ligation.

c) Tšilafalo ea RNA e lebisa ho ts'oaetso e sa nepahalang ea mantlha ea DNA ea RNA e kanna ea ba teng ts'ebetsong ea tlhoekiso ea genomic DNA, e ka lebisang ho tekanyetso e sa nepahalang ea DNA le phepelo e sa lekanang ea DNA nakong ea kaho ea laeborari. RNA e ka tlosoa ka ho alafa ka RNase.

A-1

a) Likhechana tse nyane (60 bp-120 bp) lia hlaha Likhechana tse nyane hangata ke likhechana tsa adapter kapa lisepa tse entsoeng ke li-adapter. Ho itlhoekisa ka likhahla tsa Agencourt AMPure XP ho ka tlosa likaroloana tsena tsa adaptara le ho netefatsa boleng ba tatellano.

b) Ho hlaha likhechana tse kholo ka laeboraring kamora kholiso ea PCR Boholo ba sekhechana sa DNA sa laeborari se tla eketseha ka 120 bp kamora hore adapta e kenngoe. Haeba sekhechana sa DNA se eketseha ka li-bp tse fetang 120 kamora adapter ligation, e kanna ea bakoa ke ho holofatsa sekhechana se sa tloaelehang sa kholiso e fetelletseng ea PCR. Ho fokotsa palo ea mekoloko ea PCR ho ka thibela maemo.

c) Boholo bo sa tloaelehang ba likhechana tsa DNA tsa laeborari kamora adapter ligation Bolelele ba adapta ka kitng ena ke 60 bp. Ha lipheletsong tse peli tsa sekhechana se hokahantsoe le li-adapter, bolelele bo tla eketseha feela ka 120 bp. Ha o sebelisa adaptara ntle le e fanoeng ke sesebelisoa sena, ka kopo ikopanye le mofani oa thepa ho fana ka tlhaiso-leseling e nepahetseng joalo ka bolelele ba adapta. Ka kopo netefatsa hore ts'ebetso ea ts'ebetso ea ts'ebetso le ts'ebetso li latela mehato e hlalositsoeng bukaneng.

d) Boholo ba sekhechana sa DNA se sa tloaelehang pele ho adaptara ligation Lebaka la bothata bona le ka bakoa ke maemo a fosahetseng a karabelo nakong ea karohano ea DNA. Linako tse fapaneng tsa karabelo li lokela ho sebelisoa bakeng sa ho kenya DNA e fapaneng. Haeba kenyelletso ea DNA e feta 10 ng, re khothaletsa ho khetha nako ea karabelo ea metsotso e 12 e le nako ea ho qala ho ntlafatsa, 'me boholo ba sekhechana se hlahisitsoeng ka nako ena bo boholo ba 300-500 bp. Basebelisi ba ka eketsa kapa ba fokotsa bolelele ba likhechana tsa DNA bakeng sa 2-4 min ho latela litlhoko tsa bona ho ntlafatsa likaroloana tsa DNA ka boholo bo hlokahalang.

EA-2

a) Nako ea likhechana ha e ntlafatsoe sistimi ea karabelo ho lelefatsa kapa ho khutsufatsa metsotso e 3 ho etsa phetoho e nepahetseng nakong ea ho arohana.

EA-3

Kabo e sa tloaelehang ea DNA kamora kalafo ea ho arohana

a) Mokhoa o fosahetseng oa ho qhibiliha oa reagent, kapa reagent ha e tsoakane ka botlalo kamora ho qhibiliha. Thaw 5 × Fragmentation Enzyme Mix reagent leqhoeng. Hang ha e qhibilihisoa, kopanya reagent ka mokhoa o ts'oanang ka ho panya ka bonolo tlase ho tube. U se ke ua vortex reagent!

b) Sampole ea ho kenya DNA e na le EDTA kapa lintho tse ling tse silafatsang Ho tlosoa ha li-ion tsa letsoai le bahlahlobisisi mohatong oa tlhoekiso ea DNA ho bohlokoa haholo molemong oa katleho ea liteko. Haeba DNA e qhibiliha ka 1 × TE, sebelisa mokhoa o fanoeng taelong ho etsa likhechana. Haeba ho sa tsejoe hantle hore na tharollo ea EDTA ke efe, ho kgothaletswa ho hloekisa DNA le ho e qhala ka metsing a ikhethileng bakeng sa karabelo e latelang.

c) Nalane ea DNA e sa nepahalang ea boholo-holo Boholo ba DNA e arohaneng bo amana haufi le bongata ba kenyelletso ea DNA. Pele ho kalafo ea ho arohana, ho nepahala ha boleng ba DNA bo sebelisang Qubit, Picogreen le mekhoa e meng ho bohlokoa ho fumana palo e nepahetseng ea DNA tsamaisong ea karabelo.

 d) Ho hlophisoa ha sistimi e sa sebetseng ha ho latele taelo Ho hlophisoa ha sistimi e arohaneng ho tlameha ho etsoa leqhoeng ho latela litaelo. Ho etsa bonnete ba phello e ntle ka ho fetesisa, likarolo tsohle tsa karabelo li lokela ho beoa leqhoeng 'me tokiso ea sistimi ea karabelo e lokela ho etsoa kamora ho phomola ka botlalo. Kamora ho itokisa ho phethetsoe, ka kopo tlanya kapa pipet ho kopanya ka botlalo. U se ke ua vortex!

1. Mokhoa o tsoakaneng oa ho tsoaka (vortex, oscillation e mabifi, jj.) E tla baka kabo e sa tloaelehang ea likhechana tsa laeborari (joalo ka ha ho bonts'itsoe setšoantšong se latelang), ka hona ea ama boleng ba laeborari. Ka hona, ha u ntse u lokisetsa karabelo ea " Hlokomela hore o se kopane le vortex.

2. DNA e hloekileng e phahameng e tlameha ho sebelisoa bakeng sa kaho ea laeborari

■ Botšepehi bo botle ba DNA: Sehlopha sa electrophoresis se feta 30 kb, ntle le tailing

■ OD260 / 230:> 1.5

■ OD260 / 280: 1.7-1.9

3. Palo ea ho kenya DNA e tlameha ho nepahala Ho khothalletsoa ho sebelisa mekhoa ea Qubit le PicoGreen ho lekanya DNA, ho fapana le Nanodrop.

4. Likahare tsa EDTA ka tharollo ea DNA li tlameha ho netefatsoa hore EDTA e na le tšusumetso e kholo karabong ea karohano. Haeba litaba tsa EDTA li le holimo, tlhoekiso ea DNA e hloka ho etsoa pele ho tlhahlobo e latelang.

5. Tharollo ea karohano e tlameha ho lokisoa leqhoeng Tsamaiso ea ho arohana e ela hloko mocheso le nako (haholo-holo kamora ho eketsa sehokelo). E le ho netefatsa ho nepahala ha nako ea karabelo, ka kopo lokisetsa sistimi ea karabelo leqhoeng.

6. Nako ea karabelo ea ho arohana e tlameha ho nepahala Nako ea karabelo ea mohato oa ho aroloa e tla ama ka kotloloho boholo ba lihlahisoa tsa likhechana, ka hona e ama phano ea boholo ba likhechana tsa DNA laeboraring.

1. Ke sampuli ea mofuta ofe e sebetsang ho kiteng ee?

Mofuta oa sampole o sebetsang oa kit e ka ba RNA e felletseng kapa mRNA e hloekisitsoeng e nang le botšepehi bo botle ba RNA. Haeba kakaretso ea RNA e sebelisoa ho aha laeborari, ho kgothaletswa ho sebelisa rRNA depletion kit (Cat # 4992363/4992364/4992391) ho tlosa rRNA pele.

2. Na mehlala ea FFPE e ka sebelisoa ho aha laeborari ka kit ee?

MRNA ea mehlala ea FFPE e tla senyeha ho isa tekanyong e itseng, ka boits'epo bo fokolang. Ha u sebelisa sesebelisoa sena bakeng sa kaho ea laeborari, ho kgothaletswa ho ntlafatsa nako ea ho arohana (khutsufatsa nako ea ho arohana kapa ho se etse ho arohana).

3. U sebelisa mohato oa khetho ea boholo bo fanoeng bukeng ea lihlahisoa, ke eng e ka etsang hore karolo e kentsoeng e bonahale e kheloha hanyane?

Khetho ea boholo e tla etsoa ho latela mohato o tiileng oa khetho ea boholo bukeng ena ea lihlahisoa. Haeba ho na le ho kheloha, lebaka e ka ba hore lifaha tsa makenete ha li ea lekana mochesong oa kamore kapa ha li tsoakane ka botlalo, pipette ha e ea nepahala kapa mokelikeli o sala ntlheng. Ho kgothaletswa ho sebelisa malebela a nang le adsorption e tlase bakeng sa teko.

4. Khetho ea li-adapters kahong ea laeborari

Setsi sa kaho ea laeborari ha se na reagent ea adaptara, mme ho kgothaletswa ho sebelisa sesebelisoa sena hammoho le TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC ea laeborari

Phumano e lekanang ea laeborari: Qubit le qPCR li sebelisetsoa ho tseba hore na pokello ea libuka e ngata hakae le hore na molala oa pokello ea libuka o hokae. Ts'ebetso ena e latela feela buka ea sehlahisoa. Pokello ea laeborari ka kakaretso e tla fihlela litlhoko tsa tatellano ea NGS. Ho tseba palo ea liphatlalatso tsa laeborari: Ho sebelisa Agilent 2100 Bioanalyzer ho bona palo ea kabo ea laeborari.

6. Khetho ea palo ea potoloho ea matlafatso

Ho latela litaelo, palo ea lipotolohong tsa PCR ke 6-12, 'me palo ea lipotolohong tsa PCR e hlokahalang e lokela ho khethoa ho latela sampole ea ho kenya. Lilaeboraring tse hlahisang lihlahisoa tse ngata, hangata matlafatso a fetang a atisa ho hlaha ka mekhahlelo e fapaneng, e bonahatsoang ke tlhoro e kholo ho feta kamora tlhoro ea mokoloko o fumanehang ho Agilent 2100 Bioanalyzer, kapa mohopolo o fumanoeng oa Qubit o tlase ho feta oa qPCR. Boikokobetso bo bonolo ke ntho e tloaelehileng, e sa amaneng le tatellano ea laeborari le tlhahlobo e latelang ea data.

7. Li-spikes li hlaha pontsong ea Agilent 2100 Bioanalyzer

Ponahalo ea li-spikes ho Agilent 2100 Bioanalyzer bonoa ke ka lebaka la ho arohana ho sa lekanang ha disampole, moo ho tla ba le likhechana tse ngata ka boholo bo itseng, 'me sena se tla hlaka haholoanyane kamora ho ruisa PCR. Maemong ana, ho khothaletsoa hore ho se ke ha etsoa khetho ea boholo, ke hore, beha maemo a ho arohana ho 94 ° C bakeng sa metsotso e 15 e koahetsoeng, moo kabo ea likhechana e nyane ebile e tsepamisitsoeng, 'me homogeneity e ka ntlafatsoa.