FastKing RT Kit (Ka gDNase)

A-1 RNA e senyehile

—Rurfatsa RNA ea boleng bo holimo e sa silafatsoe. Boitsebiso boo RNA e ntšitsoeng ho bona bo lokela ho ba bocha ka hohle kamoo ho ka khonehang ho thibela ho senyeha ha RNA. Hlahloba botšepehi ba RNA ho gel e khethiloeng pele ho karabelo ea RT. Kamora ho ntša RNA, e lokela ho bolokoa ka 100% formamide. Haeba RNase inhibitor e sebelisoa, mocheso o futhumatsang o lokela ho ba <45 ° C, 'me pH e lokela ho ba tlase ho 8.0, ho seng joalo sesitisa se tla lokolla RNase eohle e tlamiloeng. Ho feta moo, RNase inhibitor e lokela ho eketsoa litharollong tse nang le ≥ 0.8 mM DTT.

A-2 RNA e na le li-inhibitors tsa phetolo ea phetolelo

——Reverse transcription inhibitors e kenyelletsa SDS, EDTA, glycerol, sodium pyrophosphate, spermidine, formamide, letsoai la guanidine, jj. Kopanya RNA ea taolo le sampole, 'me u bapise chai le taolo ea RNA reaction ho netefatsa hore na ho na le sesithibela-hloko. Hlatsoa pula ea RNA ka 70% (v / v) ethanol ho tlosa li-inhibitors.

A-3 Ho koala li-primers tse sa lekaneng ho sebelisetsoa ho kopanya leqheka la pele la cDNA

Etsa qeto ea hore mocheso o kenang o loketse litlhahlobo tse sebelisitsoeng tekong. Bakeng sa li-hexamers tse sa reroang, ho kgothaletswa ho boloka mocheso o le 25 ° C bakeng sa metsotso e 10 pele o fihla mocheso oa karabelo. Bakeng sa li-primers tse ikhethileng tsa liphatsa tsa lefutso (GSP), leka GSP e ngoe, kapa fetohela oligo (dT) kapa hexamer e sa reroang.

A-4 Palo e nyane ea ho qala RNA

Eketsa palo ea RNA. Bakeng sa mehlala ea RNA e ka tlase ho 50 ng, 0.1 μg ho 0.5 μg acetyl BSA e ka sebelisoa mohatong oa pele oa strand cDNA

A-5 Ho latellana ha sepheo ha ho hlahisoe ke lisele tse sekasekiloeng.

—— Leka lisele tse ling.

Karabelo ea A-6 PCR ea hloleha

——Ka RT-PCR ea mehato e 'meli, template ea cDNA mohatong oa PCR e ke ke ea feta 1/5 ea bophahamo ba modumo.

A-1 Ho hokelloa ka mokhoa o sa tobang ha li-primers le li-template

—Ke fela 3'-end ea li-primer ha ea lokela ho ba le 2-3 dG kapa dC. Sebelisa li-primers tse ikhethileng tsa Gene ho strand synthesis ea pele ho fapana le li-primers tse sa reroang kapa oligo (dT). Sebelisa mocheso o phahameng oa ho kenya mekhahlelo e seng mekae ea pele, ebe mocheso o tlase oa ho koala. Sebelisa Taq DNA polymerase e chesang haholo bakeng sa PCR ho ntlafatsa karabelo ea karabelo.

Moralo o mobe oa li-primers tse ikhethileng tsa liphatsa tsa lefutso

—— Latela melao-motheo e ts'oanang molemong oa boqapi ba litlotla.

A-3 RNA e silafalitsoe ke genomic DNA

—Tšoara RNA ka PCR-grade DNase I. Theha taolo ea ts'ebetso ntle le phetolelo e fetotsoeng ho bona tšilafalo ea DNA.

A-4 Ho thehoa ha primer dimer

Li-primers tsa meralo ntle le tatellano e tlatselletsang qetellong ea 3.

A-5 Mg e phahameng haholo²⁺ ho tsepamisa maikutlo

—Kamisetsa Mg²⁺ mahloriso bakeng sa template ka 'ngoe le motsoako oa khale

A-6 E silafalitsoe ke DNA esele

—— Sebelisa malebela a sa keneleng aerosol le li-enzyme tsa UDG.

A-1 Likahare tsa sehlahisoa sa pele sa strand li holimo haholo

Fokotsa palo ea sehlahisoa sa pele sa likhoele mohatong o tloaelehileng oa karabelo ea PCR.

A-2 Chelete e phahameng haholo bakeng sa karabelo ea PCR

—— Fokotsa tlhahiso ea mantlha.

A-3 Lipotoloho tse ngata haholo

Amohela maemo a karabelo a PCR le ho fokotsa palo ea potoloho ea PCR.

A-4 Mocheso o kenang o tlase haholo

Eketsa mocheso o tlatsetsang ho thibela ho qalisoa le ho eketsoa ho sa ikhethang.

Tlatsetso e sa tobang ea A-5 ea likhechana tsa oligonucleotide tse hlahisitsoeng ke ho senyeha ha DNA ea DNase ——Khetholla RNA ea boleng bo holimo ho thibela tšilafalo ea DNA.

RT-PCR ke ho khutlisetsa phetiso ea RNA ho cDNA, ebe u sebelisa cDNA e ngotsoeng ka morao e le template ea karabelo ea PCR ho holisa sekhechana sa sepheo. Khetha mefuta e meng e sa reroang, Oligo dT le li-primers tse ikhethileng tsa liphatsa tsa lefutso ho latela maemo a itseng a liteko. Li-primers tsohle tse kaholimo li ka sebelisoa bakeng sa sele e khuts'oane ea eukaryotic cell mRNA ntle le sebopeho sa moriri.

Tlhahiso ea Random: E loketse RNA e telele e nang le sebopeho sa moriri, hammoho le mefuta eohle ea RNA joalo ka rRNA, mRNA, tRNA, jj. E sebelisoa haholo bakeng sa karabelo ea RT-PCR ea template e le 'ngoe.

Oligo dT: E loketse RNA e nang le tailing ea PolyA (prokaryotic RNA, eukaryotic Oligo dT rRNA le tRNA ha e na mehatla ea PolyA). Hobane Oligo dT e tlameletsoe mohatleng oa PolyA, boleng ba mehlala ea RNA bo hlokahala hore bo be holimo, mme le nyenyefatso e nyane e tla fokotsa haholo palo ea synthesis ea bolelele bo felletseng ba cDNA.

Tlhahiso-pele ea Gene: E tlatselletsa tatellano ea template, e loketseng maemo ao tatellano ea sepheo e tsejoang.

Ho na le mekhoa e 'meli:

1. Mokhoa o ka hare oa litšupiso: Ka khopolo, cDNA ke likhechana tsa DNA tsa bolelele bo fapaneng, ka hona sephetho sa electrophoresis ke smear. Haeba bongata ba RNA bo le tlase, ha ho sehlahisoa se tla bonts'a electrophoresis, empa sena ha se bolele hore ha ho sehlahisoa se tla holisoa ke PCR. Ka kakaretso, litšupiso tsa kahare li ka sebelisoa ho fumana cDNA. Haeba ts'ebetso ea kahare e na le litholoana, boleng ba cDNA bo ka netefatsoa (maemong a 'maloa, haeba sekhechana sa liphatsa tsa lefutso se le telele haholo, ho ka ba le mekhelo).

2. Haeba ho na le liphatsa tsa lefutso tse tsebahalang tse ekelitsoeng ke template ena, li ka netefatsoa ke li-primers tsa lefutso lena. Ho holisa litšupiso tsa kahare ha ho bolele hore ha ho na bothata ka cDNA. Hobane ts'upiso ea kahare e na le bongata bo bongata ba cDNA, ho bonolo ho e ntlafatsa. Haeba cDNA e senyehile hanyane ka mabaka a fapaneng, ho latela pono ea monyetla, liphetho tsa PCR tsa liphatsa tsa lefutso tse tlase li tla ameha haholo. Le ha litšupiso tsa kahare li ntse li le ngata ka bongata, kholo ea eona e kanna ea se amehe.

Ho senyeha ha karolo ea RNA. Lekola botšepehi le tlhoekiso ea RNA

Likateng tsa RNA tsa mefuta e fapaneng li kanna tsa fapana, empa ka kakaretso, RNA e ntšitsoeng e lokela ho ba le lihlopha tse peli tse hlakileng tsa 28S le 18S ho gel electrophoresis, mme khanya ea sehlopha sa pele e lokela ho phahama habeli ho feta ea ea morao-rao. Sehlopha sa 5S se bonts'a hore RNA e senyehile, 'me khanya ea eona e lekana le boemo ba ho senyeha. Kholiso e atlehileng ea litšupiso tsa kahare ha e bolele hore ha ho na bothata ka RNA, hobane ts'upiso ea kahare e ngata haholo, RNA e ka holisoa ha feela tšenyo e se matla. OD₂₆₀/ OD₂₈₀Karolelano ea RNA e hloekileng e lekantsoeng ka spectrophotometer e lokela ho ba lipakeng tsa 1.9 le 2.1. Phofo e nyane ea protheine ho RNA e tla fokotsa sekhahla. Hafeela boleng bo se tlase haholo, RT e ke ke ea ameha. Ntho ea bohlokoa ka ho fetisisa bakeng sa RT ke botšepehi ba RNA.

Ho atolosoa ha liphatsa tsa lefutso tsa kahare ho ka bonts'a feela hore RT e atlehile, empa ha se hakaalo hore e amana le boleng ba strand ea cDNA. Hobane likhechana tsa ka hare tsa litšupiso hangata li nyane ka boholo ebile li na le polelo e phahameng, ho bonolo hore li atlehe phetisong e fetotsoeng. Leha ho le joalo, boholo le polelo ea sepheo sa lefutso li fapana ho ea ka liphatsa tsa lefutso. Boleng ba cDNA bo ke ke ba ahloloa feela ke litšupiso tsa kahare haholo bakeng sa likhechana tsa sepheo tse telele ho feta 2 kb.

Mehlala e meng e na le meaho e rarahaneng ea mahareng, kapa e na le litaba tse ruileng tsa GC, kapa e bohlokoa ka bongata bo tlase. Maemong ana, ho lokela ho khethoa reverse transcriptase e loketseng ho latela boholo ba sekhechana sa sepheo le sampole. Bakeng sa litempele tsa RNA tse nang le litaba tse phahameng tsa GC le sebopeho se rarahaneng sa sekondari, ho thata ho bula sebopeho sa bobeli ka mocheso o tlase, kapa ka reverse transcriptase e tloaelehileng. Bakeng sa li-template tsena, Quant Reverse Transcriptase e ka khethoa, hobane ts'ebetso ea eona ea transcript e hlakileng e betere ho feta ea M-MLV series reverse transcriptase, e ka fetolang lingoloa tse fapaneng tsa RNA ka nepo le ho ngola RNA ho strand ea pele ea cDNA ho isa tekanyong e phahameng. Ha o sebelisa sesebelisoa se akaretsang sa transversease transcriptase, sistimi ea 20 μl e ka khutlisa sengoloa se le seng sa 1 μg ea RNA kaofela. Ka kopo ela hloko palo e phahameng ea lisebelisoa tsa RT. Haeba template e kentsoe ka mokhoa o fetelletseng, phetolelo e fetotsoeng e tla rata RNA ka bongata bo phahameng. Ka hona, ho molemo hore o se ke oa feta bokhoni bo phahameng ba sistimi.

A-1 Fumana haeba RNA e senyehile hampe le hore na RT e atlehile

Ka kakaretso, lebaka la ho hloleha ha kholiso ea litšupiso tsa kahare hangata e bakoa ke ho senyeha ho tebileng ha RNA. Lebaka le leng le ka bang teng ke ho hloleha ho fetisa sengoloa. Tšupiso ea ka hare e ke ke ea sebelisoa e le tekanyetso ea ho ahlola boleng ba cDNA strand e le 'ngoe, empa e ka sebelisoa e le tekanyetso ho ahlola hore na phetolelo e fetotsoeng e atlehile haeba ho se na bothata ba boleng ba RNA. Ntho ea bohlokoa ka ho fetesisa ts'ebetsong ea sengoloa ke ho boloka mocheso o sa fetoheng le sistimi e arabelloang khafetsa molemong oa ho ntlafatsa ts'ebetso ea ts'ebetso.

A-2 Etsa qeto ea hore na li-primers tsa ho matlafatsa liphatsa tsa lefutso tsa ka hare li ka tšeptjoa le haeba ho na le mathata ka li-reagents tse sebelisoang ho PCR.

Bakeng sa quantification e lekanyelitsoeng, RNA e tlameha ho lekanyetsoa pele ho phetolelo e khutlisetsoang morao, e leng hape e hlokahalang ho li-kits tse ngata tse fetolelitsoeng, ka mohlala, lekanyetsa kenyelletso ea RNA joalo ka 1 μg. Kaha cDNA e ngotsoeng ka morao ke tharollo e kopaneng, ho kenyeletsoa RNA, oligo dT, enzyme, dNTP, esita le masalla a manyenyane a DNA, ho kheloha ho tla bakoa, ka hona ho ke ke ha khoneha ho lekanya cDNA hantle. Ka hona, ho hlokahala Rost quantification. Ha ho nahanoa hore ts'ebetso ea phetolelo e khutšoane e ts'oana har'a mehlala e fapaneng, palo ea cDNA e fumanoeng e lokela ho ts'oana, mme tlhahlobo ea bongata e ka bonts'a papiso ea maemo a liphatsa tsa lefutso a fapaneng ka bongata bo lekanang ba RNA kaofela. Ha o etsa PCR e lekanyelitsoeng ea fluorescence, cDNA e ngata e kanna ea se hlokehe kamora ho ngola ka morao hobane lefutso le ka hare le ka sebetsa joalo ka tšupiso.

E amana haholo-holo le liphatsa tsa lefutso, 'me phetolelo ea sekhechana se selelele ha e khonehe bakeng sa liphatsa tsa lefutso tse ngata. Taba ea mantlha, ts'ebetso ea phetolelo e fetotsoeng e tlase haholo ho feta ea PCR. Taba ea bobeli, sebaka se ruileng sa GC le sebopeho sa bobeli sa liphatsa tsa lefutso tse ngata li thibela ho fetoloa hoa phetisetso le PCR. Kamora nako, ho ba thata ho netefatsa botshepehi le ntlafatso ea PCR ka nako e le ngoe. Ha ho ntse ho etsoa transcript, ha ho motho ea ka netefatsang hore o tla fumana sekhechana se selelele bakeng sa liphatsa tsa lefutso tse tlase, haholoholo a sebelisa oligo dT. Ha e le 5 'UTR e nang le GC e ngata, ho thata le ho feta. Ka hona, e ntse e le mokhoa o utloahalang oa ho khutlisa sengoloa ka li-primer tse sa reroang, fumana libaka tsa tlhaho tsa cleavage sekhechaneng sa sepheo, se holise ka likarolo, ebe o etsa thibelo ea ts'ebetso ea ts'ebetso ea lijo le ligation. Ka kakaretso, ho thata ho holisa ka kotloloho likhechana tse kholo ho feta 2 kb, empa ha se kamehla ho leng thata ho li fumana: 1. Pele ho tsohle, netefatsa botshepehi ba RNA / mRNA, mme ho khethoa TRIZOL. 2.M-MLV RT-PCR kit e ka sebelisoa ka kotloloho. Eketsa nako ea ho koala le ho eketsa palo ea potoloho ts'ebetsong ea kholiso hantle. Ntle le moo, PCR e nang le sehlaha e ka sebelisoa, kapa ea etsa karabo e le 'ngoe kapa tse peli pele ka nako e atolositsoeng e nepahetseng le nako ea katoloso pele ho kholiso e tloaelehileng ea PCR, e ka thusang ho holisa likhechana. Ela hloko botšepehi ba polymerase. 3.Long Taq e ka sebelisoa ho PCR ho fumana litholoana tse ntle. Bakeng sa ts'ebeliso ea polelo ea protheine, ho ts'epahala ho phahameng polymerase ho lokela ho sebelisoa.

Ho na le mefuta e 'meli ea reverse transcriptase e fanoang ke TIANGEN: Quant / King RTase le TIANScript M-MLV. Phapang e kholo lipakeng tsa bona ke palo ea ho kenya li-template. Quant ke reverse transcriptase e ikhethileng, e fapaneng le M-MLV e sebelisoang hangata e tsoang ho vaerase ea Moloney murine leukemia. Quant ke sesebelisoa se secha se sebetsang hantle haholo se hlahisoang ke boenjineri Escherichia coli. Palo e loketse ho holisa 50 ng-2 μg ea RNA e nang le ts'ebetso e phahameng ea phetisetso le kotulo e phahameng. Ha e bapisoa le MMLV e tloaelehileng kapa AMV, tšobotsi e kholo ka ho fetisisa ea Quant ke hore e na le kamano e matla haholo le li-template tsa RNA mme e ka fetola li-template tse rarahaneng tse se nang mocheso o phahameng oa mocheso. Bakeng sa litempele tse nang le likateng tse phahameng tsa GC, ts'ebetso e fapaneng e phahame. Leha ho le joalo, reverse transcriptase ena e na le tšebetso ea RNase H, e ka amang bolele ba sehlahisoa sa cDNA (se loketseng li-template tsa <4.5 kb). Bakeng sa phetolelo e tloaelehileng, ho khothalletsoa TIANScript MMLV reverse transcriptase. RTase ena ke enzyme e fetotsoeng e nang le tšebetso e fokolang haholo ea RNase H, e loketseng tšebetso ea nako e telele (> 5 kb) cDNA.

Mohato o le mong oa phetisetso ea phetisetso le khothaletso ea PCR li phetheloa ka har'a tube e le 'ngoe ntle le ho bula sekoaelo sa tube pakeng tsa cDNA synthesis le amplification, e thusang ho fokotsa tšilafalo. Kaha lisampole tsohle tsa cDNA tse fumanoeng li sebelisetsoa ho holisa, kutloisiso e phahame, ka bonyane ba 0.01 pg ea RNA e felletseng. Bakeng sa RTPCR ea mohato o le mong o atlehileng, hangata li-primers tse ikhethileng tsa liphatsa tsa lefutso li sebelisetsoa ho qala synthesis ea cDNA. Mokhoa oa mehato e 'meli, e leng phetisetso ea phetolo le ntlafatso ea PCR o etsoa ka mehato e' meli. Pele phetolelo e fetotsoeng e etsoa ho tsoa ho template ea RNA ho fumana cDNA, mme cDNA e fumanoeng e tlas'a tšebetso e le 'ngoe kapa tse fapaneng tsa PCR. Mokhoa oa mehato e 'meli o ka sebelisa oligo (dT) kapa li-primers tse sa reroang ho tataisa tšebetso ea leqheka la pele la cDNA, mme e ka khutlisa phetiso ea tlhaiso-leseling eohle ea mRNA ho tsoa sampoleng e itseng.